現在、研究、製薬、タンパク質の精製のために様々な技術が用いられておりますが、その中でもクロマトグラフィーは、生体分子の精製に不可欠な技術の一つとして長い間利用されています。クロマトグラフィーでは、固相担体で構成されるクロマトグラフィーマトリックスに混合サンプルを通過させます。クロマトグラフィーマトリックスの特性は、担体の構造や化学的性質によって決まります。精製対象とするサンプルの性質により、どの種類の担体を選べばよいのかは異なります。 Show 例えば、細胞培養物または血清などを含む複雑なサンプルからのタンパク質精製は、いくつかのクロマトグラフィー方法を用いて行います。第1の工程として、イオン交換またはミックスモードカラムを用いたクロマトグラフィーを行い、サンプルを分画し、標的分子を含むタンパク質の集団を得た後、続けて、目的とする精製純度レベルに達するまで、その集団をさらに分画するための工程として、アフィニティーまたはサイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過もしくはゲル浸透ろ過）、または、イオン交換またはミックスモードカラムを使用したクロマトグラフィーを行い、最終的に、標的タンパク質を単離することができます。 ポールは様々な用途と処理容量用のクロマトグラフィーメンブレン製品を提供しており、お客様のタンパク質精製を包括的にサポートします。 イオン交換クロマトグラフィーは、物質をその正味の表面荷電に基づいて分離します。分子は陰イオン（負の電荷を持つ）、陽イオン（正の電荷を持つ）のどちらかに分類されますが、タンパク質類などの分子によっては陰イオン・陽イオンの両方を持つものがあります。正電荷の担体（陰イオン交換体）は「全体として負電荷の成分」を結合し、反対に負電荷の担体（陽イオン交換体）は「全体として正電荷な成分」を結合します。 イオン交換体は結合力の強弱によりさらに細かく分類することができます。強イオン交換体は広範囲のpHでチャージ（イオン化）され、弱イオン交換体は限られたpH範囲でしかイオン化しません。 以下に、もっとも代表的な4 種のイオン交換体を示します。
バッファーの選択 一般的にイオン交換クロマトグラフィーでは、イオン強度の低いバッファーをロードします。この条件下では、電荷を帯びた高分子は反対の電荷をもつ固相に捕捉され、固相と同じ電荷をもつ高分子は吸着せずに通過します。イオン強度の低いバッファーをさらに加えて交換体を洗浄すると、残存していた非吸着な成分が完全に洗い流されます。 その後、塩濃度を上げたバッファーを加えることで、イオン交換体に吸着した成分を溶出します。移動相のイオン強度を上げると、塩イオンがイオン交換体上の帯電物質に吸着しようとして競合し、先に吸着していた高分子を引き離すため、その高分子をマトリックスから溶出することができます。陽イオン交換には陰イオンのバッファー（負電荷を持つ）を、陰イオン交換には陽イオンのバッファー（正電荷を持つ）をご使用ください。 pHの選択 pHは、強イオン交換体の電荷に影響を及ぼすことはありませんが、溶液中の高分子の電荷には影響を与えます。イオン交換クロマトグラフィーの処理pHは、バックグラウンドとなる混在物質に対して、目的分子の分解能が最大となるよう選定します。例えば、目的分子の結合量を最大にし、混在物質の結合量を最小限に抑えるpHを選定した場合（ポジティブモード）、目的分子の溶出は塩濃度を上げることで達成されます。逆に、混在物質の結合量を最大化し、目的分子の吸着量を最小限〜ゼロにするpHを選定した場合（ネガティブモード）、目的とする分子は全て通過し、混在物質がマトリックスに吸着することで分離が行われます。 イオン交換体や操作pHを慎重に選定すると、１ステップで最大の回収量と純度とを得ることができます。ただし、１つのステップで100％の純度を実現することは不可能なので、目的分子とバックグラウンドとなる混在物質の化学特性の相違を利用しながら、複数のステップを組み合わせることが必要です。 溶出塩の選択 吸着ステップの後に用いる溶出用バッファーは、塩濃度をよく選定して、目的とする分子と同時にイオン交換体に吸着している混在物質が一緒に溶出してこないよう注意します。溶出塩のイオンは、グラジエントもしくはステップで0 〜 1.0M の範囲にあり、担体上の荷電基から他の分子を置換できるものを使用します。一般的に、使用される陽イオンの置換効果はCa2+ > Mg2+ > Na+ > K+ > NH4+の順となっており、使用される陰イオンの置換効果はPO43- > SO42- > COO- > Cl-の順となっています（この順序はホフマイスター系列を元にしています）。 しかしながら、もっとも強力な溶出塩が常に最適とは限りません。理想的には複数の塩をテストして、試行錯誤を伴いながら最適な溶出条件を見つけるべきです。一般的に使用しやすい、NaClやKClから条件検討を始められるでしょうが、CaCl2やMgCl2も考慮するべきです。また溶出塩の選定の際には、目的分子の純度、安定性、活性に対する影響も考慮する必要があります。 ポールのイオン交換クロマトグラフィー用製品は、メンブレン製品があります。クロマトグラフィーにおいて、一般的には主にレジンベースの手法が用いられています。一方で、レジンベースの処理に限界がある場合（例えばウイルスや大きな分子の精製など）には、メンブレンが頑丈かつスケーラブルで、経済的な方法となることが知られています。メンブレンはレジンよりも高い流速を持ち、レジンでは限界があるアプリケーションでよく機能します。 イオン交換クロマトグラフィーにおけるムスタング メンブレンの使用 大きな分子の精製が必要な場合や、より速い流速が必要なクロマトグラフィーでは、メンブレンの使用が推奨されます。メンブレンクロマトグラフィーは、従来のレジンを用いたクロマトグラフィーに比べて著しく速い流速での処理が可能です。これにより処理時間を短縮し、スループットが増加できるため、処理が極めて経済的となります。 ポールのムスタング メンブレンは対流性の高い孔構造と、高い流速でも比較的左右されない動的結合容量を持っており、プラスミドやウイルスのような大きな分子にも適しています。ポールのイオン交換クロマトグラフィー用メンブレンデバイスは、お客様に以下の利点をご提供しています。
イオンクロマトグラフィーの分離法として主にイオン交換が用いられていますが、原理がわかると測定目的に合った分離の調節やカラムの選択に役立ちます。今回は、イオン交換分離の原理の説明とイオン交換分離に影響する4つの因子をご紹介します。 ▼もくじ イオン交換分離の原理イオン交換分離は、イオン交換基と電解質溶液との間で、イオン成分が吸着と脱離を繰り返すことによって起こります。陰イオン交換分離の場合、たとえば、第４級アンモニウム基が修飾されたイオン交換体が充填されたカラムと、炭酸ナトリウムなどのアルカリ性溶液の溶離液を用いるとします。カラム内では、溶離液中の炭酸イオン（CO32-） がイオン交換基上で吸着と脱離を繰り返しています（図1-1）。そこへ、測定イオン、たとえば、塩化物イオン（Cl–）と硫酸イオン（SO42-） が導入されると、CO32-に代わってCl–とSO42-がイオン交換基と吸着します（図1-2）。溶離液が連続的に流れているので、いったん吸着したCl–とSO42-は順次CO32-に置き換えられます（図1-3）。脱離したCl–とSO42-は次のイオン交換基に吸着し、またCO32-に置き換えられ、また吸着し…と吸着と脱離を繰り返して、最後にはカラムから溶出されます。  図1 陰イオン交換原理図 吸着と脱離を繰り返す際に分離が起こります。分離は、Cl–とSO42-のイオン交換基や溶離液との親和性の違いによって起こります。分離のイメージを図2 に示します。一般に、電荷数の大きいイオンほどイオン交換基との静電的相互作用が大きいため、強く吸着します。また、イオンの疎水性の影響も大きく、疎水性が高い場合は保持が強くなります。イオン半径の大きいイオンは、半径の小さいイオンに比べイオン交換基に強く吸着します。このため、1 価の陰イオンのイオン交換体への吸着は、F–<Cl–<Br–<I–、1 価の陽イオンはLi+<Na+<K+<Rb+<Cs+の順で強く保持されます。イオン交換分離では、いくつかの作用が同時に働きますが、ある程度は分離の推測が可能で、コンピューターでシミュレーションできます。しかし、実際は用いるカラム、溶離液、温度などにより分離は大きく変わります。 図2 カラム内での分離の模式図 溶離液の濃度と種類陰イオン溶離液中の炭酸イオン（CO32-）や水酸化物イオン（OH–）、陽イオン溶離液中の水素イオン（H+）などを溶離剤イオンと言います。イオン交換分離では、イオン交換基上における測定イオンと溶離剤イオンとの競合により分離が行われます。溶離剤イオン濃度（溶離液濃度）が低くなると、測定イオンと溶離剤イオンとの競合が小さくなり、測定イオンがイオン交換基に保持される時間が長くなるため溶出は遅くなります（図3）。特に多価の測定イオンはイオン交換基に対する親和性が強いため、保持時間が極端に長くなる傾向があります。溶離液濃度と保持の大きさを示すキャパシティーファクターの関係（図4）を見ると、測定イオンの価数が高いほど傾きが大きくなっていることがわかります。 図4 溶離液濃度とキャパシティーファクター（K’）の関係。k’=(tR-t0)/t0、tR:ピークの保持時間、t0:ウォーターディップ溶出時間、条件は図3と同じ 2 価の溶離剤イオンは、1 価に比べて測定イオンをイオン交換基から速く脱離させることができるため、溶出を速くできます。陰イオン溶離液の溶出力は、Na2CO3>NaHCO3>NaOH（KOH）の順になります（図5）。陽イオン溶離液の溶出力は、H2SO4>メタンスルホン酸=HCl の順になります（HCl は電解型サプレッサーでは使用できませんのでご注意ください）。また、溶離液のpH を変化させると、多段階解離しているイオン（りん酸など）の溶出位置を大きく変えることができます（図6）。 図6 溶離液pH とキャパシティーファクター（K’）の関係。カラム：Dionex IonPac AS22、溶離液：4.6 mmol/L Na2CO3（1.2 mL/min）、NaHCO3でpH調整。 カラム温度カラム温度を変化させると、分離平衡、拡散速度、解離度、溶離液の粘性などの変化により、測定イオンの保持時間が変化します。温度の影響は測定イオン種によって異なり、カラムや溶離液によっても変わります。一般的に温度を上げると溶離液の粘性が下がり、イオン交換基上での溶離剤イオンと測定イオンの交換速度が速くなるため溶出が速くなる傾向があります。一方で、硫酸イオンのように水和していると考えられるイオンは、温度上昇に伴い水和状態が不安定になることで、イオン交換基への親和性が増大し、溶出が遅くなると考えられています。図7にカラムや溶離液が異なる条件での、温度と保持時間の関係を示します。1価のイオンに対して、2、3 価の硫酸イオンやりん酸イオンは保持時間の変化が大きいことがわかります。変化の程度も、溶離液条件によって大きく変わることがわかります。 図7 温度と陰イオンの保持時間（k’; キャパシティーファクター）の関係 カラム温度の変化により測定イオンによっては保持挙動が変わることから、温度を使って分離状態を調節できます。図8 にDionex™ IonPac™ CS16カラムを用いたときの、陽イオンとエタノールアミンの分離例を示します。このカラムでは、温度を上げることにより、アンモニウムイオンとモノエタノールアミン、カリウムイオンとトリエタノールアミンの分離を改善することが可能です（注：カラム温度を40℃以上にする場合は、取扱説明書をご参照の上サプレッサーに高温の溶離液が入らないようにしてください）。 イオン交換基の疎水性イオン交換は、主に測定イオンと溶離剤イオンのイオン交換基上での静電的相互作用によって分離が行われていますが、疎水性相互作用も分離に影響を与えます。 疎水性は、カラム基材の影響をもっとも強く受けますが、基材が同じであればイオン交換基の種類で変わります。たとえば、エチルビニルベンゼン/ジビニルベンゼン共重合体の基材は、メタクリレート系やポリビニルアルコール系よりも非常に疎水性が高いことが知られています。イオン交換基の例では、陰イオン交換に用いられるアルカノールアミンはアルキルアミンよりも疎水性が低く、分離の調整がしやすいです。基材自体の疎水性が高くても、イオン交換基を導入する前に基材をレイヤーで覆って疎水性を緩和するといった技術もあり、近年では疎水性の低いカラムが多く用いられているようです。 疎水性が比較的高いイオン成分（ヨウ化物イオン、チオシアンイオン、過塩素酸イオンなど）は保持時間も長く、テーリング気味のピークですが、疎水性の低いカラムを用いると疎水性相互作用が小さくなるため、保持時間の短縮やピーク形状の改善が行えます（図9）。 図9 カラムの疎水性と分離の違い 溶離液の疎水性を変化させることによっても分離を調整できます。溶離液の疎水性はアセトニトリルなどの有機溶媒を添加することによって変えます。図10 は、溶離液に添加したアセトニトリルの濃度による、一般的な陰イオンのキャパシティーファクター（k’）の変化を示したものです。アセトニトリルの濃度の増加により、臭化物イオン、硝酸イオンで保持時間の短縮が見られ、りん酸および硫酸イオンで保持時間の増加が見られます。疎水性がこれらのイオンよりも高い成分については、さらに顕著な効果があります。なお、溶離液へ有機溶媒を添加する方法については、適用できないカラムや、サプレッサーの使用モードの制限がありますので、取扱説明書をご確認ください。測定目的成分に応じて、カラムまたは溶離液の疎水性を選択／調節することで、分離の最適化やピーク形状の改善が可能です。 図10 有機溶媒添加による保持の変化。カラム：Dionex™ IonPac™ AS12A、溶離液： 2.7 mmol/L Na2CO3、0.3 mmol/L NaHCO3、アセトニトリル、流量： 1.2 mL/min 溶離液の流量溶離液の流量を変えると、溶出時間は両対数グラフにおいて直線的に変化します。このとき、ピークの溶出順序は変わりません。つまり、溶離液流量の変化では分離の改善はあまり期待できません。図11 に示した流量2.0 mL/min（A）、0.5 mL/min（B）のときのクロマトグラムで、流量の少ない（B）の分離が一見良いようですが、（A）の時間軸を引き伸ばすと（B）の分離とあまり変わらないことがわかります。 図11 流量が異なるときのクロマトグラムの違い 一方で、流量を少なくすると測定イオンが電気伝導度セル内をゆっくり通過するため、ピーク面積が大きくなります（図12）。今回用いた条件では、流量が2.0 mL/min のときの面積値は0.5mL/min のときの3.6 倍でした。流量を少なくするとピーク幅も大きくなるため、面積値が大きくなっても感度の目安となるピーク高さは同様の割合では増加しませんが、それでも大きくなります（図13）。今回用いた条件では流量0.5 mL/min のときは2.0mL/min のときの1.2 倍のピーク高さでした（図11）。保持時間が問題にならなければ、流量を少なくすることで感度を改善することが可能と言えます。一般に、カラムは適切な流量範囲（または圧力範囲）が決まっており、その範囲で使用しなければなりません。流量を変える場合は、カラムの取扱説明書をご確認ください。 図12 溶離液流量とピーク面積の関係。分析条件は図11と同じ、流量: 0.3 ～2.0 mL/min 図13 溶離液流量とピーク高さの関係。分析条件は図11と同じ、流量: 0.3 ～2.0 mL/min 【無料ダウンロード】イオンクロマトグラフィーお役立ち資料（基礎編）イオンクロマトグラフを使い始めようと考えている、分離の原理や分析時のポイントを見直したい、ソフトウェアの機能を使いこなしたい、具体的な分析事例を知りたいなど。業務にすぐに役立つノウハウが詰まった資料をぜひ、ご活用ください。 無料ダウンロードはこちら 【無料】 e-learning イオンクロマトグラフィー基礎知識イオンクロマトグラフィーについて、より深く学びたい方は、e-learning(オンラインセミナー)をご利用ください。 分離や検出法などの原理を中心とした基礎の解説や、実際の分析時に注意するポイントまで、業務に役立つヒントが学べます。 視聴のお申し込みはこちら 研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。 記事へのご意見・ご感想お待ちしていますイオン交換クロマトグラフィーの利点は？イオンクロマトグラフィーは、ほとんどの無機陽イオン、無機陰イオン、有機酸、その他のイオンの分離分析に有効な方法であり、少量の試料で複数のイオンを同時に測定でき、共存物質の干渉も少なく、高感度で自動化が容易であるなどの特徴をもっている。
イオンクロマトグラフィーの欠点は？イオンクロマトグラフィーで測定できる試料
酸やアルカリで溶解できるものやアルコールなどの有機溶媒で溶解できる試料も一部対象ですが、測定目的成分以外の物質が大量に試料に入っていると、分析精度が著しく低下したり、測定目的成分が妨害を受けて測定できないことがあります。
イオンクロマトグラフィーの注意点は？イオン交換クロマトグラフィー. 最も注意するべきことは、担体への結合を阻害する塩やイオン性界面活性剤などの荷電性物質です。 ... . きれいな分離能を求めるには、サンプル溶液量、濃度、粘性が重要です。 ... . 担体への吸着は静電的作用の低い高塩濃度下で行うため、サンプル溶液の塩濃度も高めておきます。. イオン交換クロマトグラフィーの分離方法は？イオン交換クロマトグラフィー
これはイオン結合によるものです。 試料をイオン交換体を詰めたカラムに結合させた後、溶媒の塩濃度を高くしていくと、イオン結合 が弱くなっていきますので、結合力の弱いタンパク質から順に外れて流れ出てきます。 このように、タンパク質が電荷によって分離されます。
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イオン交換クロマトグラフィーの回収率は？
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